Vibrio cholerae no-O1 asociado a diarreas: factores de virulencia y diversidad genética de un patógeno emergente en Latinoamérica

Abstract

V. cholerae no-O1 ha sido asociado con casos esporádicos de diarrea y con infecciones invasivas (Morris et al., 1990, 1994), y ha sido reconocido en reservorios ambientales (Colwell et al., 2006). Sin embargo, la capacidad y el rol patogénico de V. cholerae no-O1 no está tan estudiada e investigada como la asociación de V. cholerae a cólera epidémico y a los serogrupos O1/O139. La emergencia de una nueva cepa V. cholerae no-O1 con características epidémicas en India, serogrupo O139 en 1992; destacó la necesidad de la vigilancia de otros serogrupos de V. cholerae. En este estudio el objetivo fue caracterizar feno-genotípicamente y establecer la diversidad genética de cepas de Vibrio cholerae no-O1 de origen humano y ambiental circulantes en Argentina en un periodo amplio de tiempo (1992 – 2003) a los fines de identificar perfiles genéticos de este microorganismo con potencial patogénico. De un total de 1302 aislamientos remitidos al Laboratorio Nacional de Referencia (LNR) desde la implementación de la vigilancia activa del cólera en 1992 hasta el año 2003, se seleccionaron 170 aislamientos de V. cholerae no-O1. Entre ellos, se estudiaron para determinar la distribución de genes asociados a factores de virulencia 111 de casos clínicos y 59 de origen ambiental procedentes de diferentes regiones de Argentina, incluyendo 20 aislamientos correspondientes a un brote ocurrido en Salta en el año 2000. La caracterización genotípica fue realizada a través de la implementación de protocolos de PCR descriptos para la identificación de los genes ctxA (toxina de cólera), tcpA (factor de colonización TCP alelo ElTor/Clásico), toxR (gen regulador), rtxA (citotoxina), hly (hemolisina), tcpI, y stn (toxina termoestable). En una selección de 30 aislamientos que presentaron diferentes perfiles genotípicos se estudió la enterotoxicidad mediante un ensayo de acumulación de fluído en asa ligada de conejo (colaboración con CIBICI, FCQ, Universidad Nacional de Córdoba). Finalmente, se realizó un estudio de diversidad genética de los 170 aislamientos por electroforesis en campo pulsado (PFGE) según Dalsgaard et al., 1996 y en la misma selección de aislamientos ensayada para enterotoxicidad se aplicó el protocolo estandarizado de PFGE de la Red PulseNet Internacional. Casi la totalidad de los aislamientos estudiados fueron V. cholerae no-O1, excepto un aislamiento de V. cholerae O139; y resultaron negativos para los factores de virulencia asociados a cólera epidémico CT y/o TCP, excepto un aislamiento de origen ambiental portador de los genes ctxA y tcpI. Entre los perfiles genéticos determinados por PCR, V. cholerae no-O1 portador de los genes hlyA, toxR y rtxA resultó el más prevalente con una frecuencia del 82,9%. Otros perfiles genotípicos identificados en menor frecuencia, presentaron la combinación de la hemolisina (hlyA) con otros factores de virulencia, tales como ctxA, tcpI y/o stn entre un rango de 0,60% al 5,9% y distribuído en aislamientos de origen humano y del ambiente. Resultó de interés el hallazgo de un aislamiento V. cholerae no-O1 ambiental ctxA tcpA alelo Clásico, tcpI; un aislamiento V. cholerae O139 de un caso clínico toxR, rtxA, hly; y cinco aislamientos portadores de tcpA alelo Clásico entre diez cepas V. cholerae tcpI positivas. En general no hubo grandes diferencias en los perfiles genéticos determinados en aislamientos de origen humano como ambiental, señalando el ambiente como reservorio de cepas con potencial patogénico. Las cepas analizadas en el ensayo de enterotoxicidad fueron capaces de inducir acumulación de fluídos en un amplio rango de valores inclusive con un mismo perfil genotípico, indicando que una combinación de factores de virulencia u otras variables relacionadas con la expresión fenotípica intervienen en las propiedades de virulencia de V. cholerae no-O1. El estudio de subtipificación molecular demostró la gran diversidad genética de los aislamientos de origen clínico y ambiental, salvo algunas excepciones que presentaron un mismo perfil genotípico. Entre ellos se identificaron 7 grupos o “clusters” incluyendo 2 a 3 aislamientos cada uno, de casos clínicos y reservorios ambientales (ríos, estuarios, canales) de varias provincias: 6/7 procedentes del mismo lugar y relacionados temporalmente dentro de cada grupo. En 1/7 se identificó un subtipo genético que incluyó aislamientos de diferentes provincias y año asociado al perfil genético de V. cholerae no-O1 toxR, rtxA, hly, tcpI. Además, la aplicación de PFGE demostró el origen policlonal del brote de Salta asociado a 13 diferentes serogrupos de V. cholerae, que presentaron 18 perfiles de PFGE distintos. Los subtipos circulantes obtenidos por el protocolo estandarizado de la Red PulseNet fueron ingresados a la Base Nacional de subtipos de V. cholerae, resultando diferentes a las cepas epidémicas de V. cholerae O1 de la década del 90`. La identificación de los perfiles genéticos de virulencia circulantes en el país permitió el diseño de un flujograma diagnóstico que fue transferido en el marco de la Red Nacional de Diarreas. Este trabajo permitió la aplicación de herramientas moleculares para el diagnóstico, caracterización y vigilancia de V. cholerae no-O1 en el país.