Clonado y expresión de la proteína estructural de cápside VP6 de Rotavirus Humano A en el sistema baculovirus-células de insecto

Abstract

Los rotavirus grupo A son la causa más común de gastroenteritis aguda en niños menores de 5 años. Se estima que más de 450.000 niños mueren por esta enfermedad cada año a nivel mundial sin embargo alrededor del 90 % de estas fatalidades ocurre regiones pobres. Las infecciones por RVs continúan generando costos directos significativos para los sistemas de salud. El uso de pruebas diagnósticas comerciales de origen importado constituye una carga económica considerable para estos sistemas en países en desarrollo. El ensayo ELISA es la metodología de uso principal en el diagnóstico de rotavirus humano A debido a su sencillo uso y rapidez en la obtención de resultados. En tal sentido, con el fin de optimizar y complementar la elaboración de los componentes del ensayo diagnostico ELISA para la detección de rotavirus humano grupo A en heces, (previamente desarrollado por el Servicio Vacuna Antirrábica del INPB ANLIS Malbrán) el objetivo general de este trabajo consistió en la producción local de la proteína estructural interna de cápside VP6 recombinante a partir de rotavirus humano A, aislados en Argentina, para su aplicación como antígeno control positivo del mencionado kit de diagnóstico. Para expresar la proteína estructural de cápside VP6 HA se empleó el sistema de expresión baculovirus-células de insecto. La secuencia completa (cDNA) del segmento 6 de RV HA que codifica para la proteína VP6 se aisló por RT-PCR y se subclonó en el vector donante pFastBac™1 del sistema Bac-to-Bac® Este sistema proveyó una manera rápida y sencilla para la generación de baculovirus Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) recombinantes AcVP6RVHA. La proteína VP6 recombinante se expresó en altos niveles en células de insecto en cultivo. El análisis por SDS-PAGE confirmó que posee un peso molecular de ~ 44 kD y que presenta la misma movilidad que la proteína VP6 de rotavirus de simio SA11 de referencia. La inmunodetección por western blot con un anticuerpo policlonal anti rotavirus humano A y la evaluación mediante el ensayo ELISA, para la detección de antígeno de rotavirus en heces, corroboraron que la VP6 HA recombinante producida en el presente estudio conserva su capacidad antigénica. El estudio complementario para ANLIS Malbrán – Universidad Nacional de San Martín 7 evaluar la posibilidad de producir partículas similares a virus, VLPs 2/6 demostró que cuando ambas proteínas estructurales de cápside de rotavirus son coexpresadas a través de la co-infección de células Sf9 con los baculovirus recombinantes AcVP2SA11 y AcVP6RVHA, la proteína VP2 SA11 de simio es capaz de interactuar con la proteína VP6 HA humana formando VLPs 2/6 quiméricas de doble capa que se autoensamblan intracelularmente y que pueden ser purificadas a partir de sobrenadantes de cultivos de células Sf9 co-infectados . Este trabajo demuestra que producir localmente la proteína estructural de cápside VP6 de rotavirus humano A, a partir de aislamientos de Argentina usando el sistema de expresión baculovirus-células de insecto es factible. La proteína VP6 recombinante expresada puede ser un componente útil para complementar el ensayo ELISA para la detección de rotavirus humano, desarrollado por el Servicio de Vacuna Antirrábica del INPB ANLIS Malbrán.