Identificación molecular de nematodes Anisákidos de impacto en la salud pública

Abstract

Los anisákidos son parásitos nematodes de la familia Anisakidae cuyo ciclo biológico se desarrolla en hospedadores acuáticos. La anisakidosis humana es causada por la ingesta de pescado crudo o insuficientemente cocido infectado con larvas de tercer estadio (L3) de los géneros Anisakis, Pseudoterranova, Contracaecum e Hysterothylacium. A pesar de que las larvas no se desarrollan en humanos, pueden vivir y causar síntomas severos, pudiendo penetrar en la pared del estómago causando dolor abdominal agudo, náuseas y vómitos a las pocas horas pos ingestión; cuando invaden la mucosa gástrica o intestinal, a menudo producen úlcera o granuloma eosinófilo; y suelen ocasionar reacciones alérgicas que van desde urticaria hasta shock anafiláctico. La globalización de hábitos alimentarios que incluyen pescado crudo o poco cocido provocó un aumento de la enfermedad en todo el mundo. Aunque los géneros de los anisákidos mencionados pueden diferenciarse mediante su morfología, las larvas recuperadas de los pacientes afectados frecuentemente presentan estructuras deterioradas, que no permiten identificar al parásito. Asimismo, la existencia de especies morfológicamente similares en anisákidos, dificulta la identificación a nivel de especie. Por lo tanto, el diagnóstico molecular constituye una herramienta muy útil para la identificación definitiva de estos parásitos. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un sistema de diagnóstico molecular de anisákidos con impacto en la salud pública: diseñar y efectuar la puesta a punto de un sistema de identificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación nucleotídica de los géneros Anisakis, Pseudoterranova, Contracaecum e Hysterothylacium; identificar a nivel de especies, los géneros estudiados y aplicar la nueva metodología para la identificación molecular de muestras procedentes de infección humana y halladas en el alimento previo a su consumo. Se obtuvieron larvas de nematodes de merluza (Merluccius hubbsi), pescadilla de red (Cynoscion guatucupa) y pez palo (Percophis brasiliensis) de la ciudad de Mar del Plata, y de Mero (Acanthistius patachonicus) y merluza adquiridos en pescaderías de la ciudad de Buenos Aires. Las larvas de anisákidos se identificaron a nivel de género de acuerdo a características morfológicas. Se diseñaron un par de cebadores a partir de una región conservada del espaciador transcripto interno 1 (ITS1) del ADN ribosomal nuclear de los géneros Anisakis, Pseudoterranova, Contracaecum y Hysterothylacium con el fin de amplificar mediante la técnica de PCR fragmentos de ADN de una longitud de 544pb, 505pb, 601pb y 583pb, respectivamente. Se elaboró un sistema de control interno de amplificación (CIA) con el objetivo de validar la precisión de la prueba. El CIA consistió en un producto de amplificación por PCR, purificado, formado por ADN quimérico del gen de la enzima Maturasa K de Arabidopsis thaliana rodeado por secuencias específicas de ADN blanco parasitario. Posteriormente, se efectuó la reacción de PCR a partir de larvas L3 obtenidas y los productos amplificados fueron analizados mediante la secuenciación nucleotídica. Las secuencias obtenidas se cotejaron con la base de datos de nucleótidos del GenBank. El método desarrollado se aplicó para la identificación molecular de tres muestras remitidas al laboratorio, una procedente de infección humana y dos halladas en un alimento. En los pescados procedentes de comercios se evidenciaron larvas de anisákidos que se identificaron como pertenecientes a Anisakis pegreffii, Contracaecum osculatum, Contracaecum sp, Hysterothylacium aduncum, Hysterothylacium deardorffoverstreetorum, Terranova sp y Pseudoterranova cattani. Esto indica que el método de identificación molecular de anisákidos desarrollado en el presente trabajo, permitió diferenciar los géneros de parásitos inicialmentente contemplados (i.e Anisakis, Pseudoterranova, Contracaecum y Hysterothylacium) y Este método se propone como una herramienta útil para la identificación de anisákidos en humanos, que podrá auxiliar al diagnóstico diferencial con otras patologías gastrointestinales, favoreciendo un tratamiento eficaz del paciente. Asimismo, esta técnica de identificación, podrá contribuir a los estudios de prevalencia y comportamiento de la anisakidosis en nuestro país.