Análisis de reactividad de la proteina p26 del virus de la anemia infecciosa equina (AIE) utilizando diferentes métodos de diagnóstico

Abstract

El virus de la Anemia Infecciosa Equina (AIE), perteneciente a la Familia Retroviridae, Subfamilia Orthoretrovirinae, Genero Lentivirus, ocasiona infección persistente en equinos, asnos y mulas (Familia Equidae), caracterizada por episodios irregulares de fiebre, depresión y anemia separados por períodos asintomáticos de quiescencia clínica. El virus tiene un genoma ARN de cadena simple con tres genes principales: gag, pol y env. El gen gag codifica una proteina de 26Kd denominada p26, que es la proteína mayor de la cápside, constituyendo aproximadamente un 40% del total de la proteína del virión. En 1970, al descubrirse que caballos infectados con AIE poseían anticuerpos precipitantes contra la proteína p26, Coggins y Norcross adaptaron un método confiable para la detección de anticuerpos en sueros de animales infectados denominado: prueba de inmunodifusión en gel de agar (IDGA) o prueba de Coggins. Esta técnica es la aceptada para tránsito internacional e interno de equinos. El antígeno utilizado en la prueba diagnóstica es preparado a partir de virus parcialmente purificado obtenido de cultivos celulares infectados y posteriormente tratado químicamente para liberar la p26. Este método de producción es de alto costo y bajo rendimiento. Si bien esta técnica ha sido una herramienta diagnóstica certera para la detección de animales infectados a partir de su implementación en los años 70, existen sueros que resultan difíciles de diagnosticar debido a que dan reacciones positivas muy débiles (borderline). En un trabajo previo la Cátedra de Virología de la Facultad de Ciencias Veterinarias de La Plata desarrolló un sistema heterólogo de producción de proteínas, utilizando Escherichia coli, para la expresión y purificación de grandes cantidades de proteína p26 recombinante (p26r) de alta calidad. Con el objetivo de analizar la reactividad de la p26r, la proteína fue utilizada como antígeno en diversas técnicas diagnósticas y se comparó su desempeño frente a 200 sueros diagnosticados previamente por las técnicas de IDGA y test de cELISA con equipos comerciales en el laboratorio de DILAB, SENASA. De este modo estos sueros fueron procesados en la Cátedra de Virología utilizando las técnicas de ELISA Indirecta y Western Blot (WB) usando para ambas técnicas la proteína p26r. Con la técnica de ELISA indirecta se realizaron estudios de factibilidad, que demostraron la necesidad de obtener un antígeno p26r más puro para poder avanzar en la estandarización de la misma. Con la técnica de WB se obtuvieron resultados comparables a los previamente determinados por las técnicas de IDGA y cELISA y de mayor sensibilidad que la IDGA, pudiendo confirmar o descartar resultados sospechosos o equívocos obtenidos con la IDGA. No obstante, como los sueros fueron enfrentados con un antígeno recombinante a p26, o con antígeno obtenido con métodos que eliminan las glicoproteínas de superficie, sólo se encontró en los sueros positivos la banda correspondiente a esa proteína y no otras bandas a otros antígenos del virus AIE, por lo cual se concluye que, siguiendo los estándares internacionales (DVL, NVSL, APHIS, USDA, USA) para el diagnóstico de AIE, se recomienda incorporar otros antígenos (como mínimo una de las glicoproteinas de superficie del virus) a las tiras del WB, de forma que esta técnica pueda ser usada como método confirmatorio.