Aplicación de una reacción de PCR–multiplex para la identificación de cepas de Staphylococcus aureus toxigénicas

Abstract

En el mundo se producen aproximadamente 1500 millones de casos de diarrea que ocurren anualmente y son el resultado directo de la contaminación química o biológica que presentan algunos de los alimentos que se comercializan (OMS, 1998). Se conocen más de 250 tipos de Enfermedades Transmitidas por alimentos, agrupándoselas según su origen en biológico o químico. Las primeras, son las más numerosas y de mayor impacto. Staphylococcus aureus ocupa un rol importante, es agente etiológico de una de las gastroenteritis mas frecuentes por consumo de alimentos contaminados, “Intoxicación alimentaria estafilocócica. Mediante la optimización y aplicación de un procedimiento basado en la reacción en cadena de la polimerasa, se identifica los genes de enterotoxinas de Staphylococcus aureus en muestras obtenidas de brotes de intoxicaciones alimentarias. Se propone así como una respuesta a una necesidad en el Laboratorio de Microbiología de Alimentos, para disponer de una herramienta eficaz y sencilla para establecer una relación entre un patógeno de transmisión alimentaria, y un evento epidemiológico. Se procesaron aislamientos de Staphylococcus aureus recuperados de muestras de alimentos en brotes de intoxicación alimentaria ocurridos en la Provincia de Santa Fe. Estas cepas fueron caracterizadas fenotipicamente con pruebas bioquímicas convencionales. Para la obtención de ADN bacteriano, se evaluaron tres procesos de extracción: Lisis por calor con agua, Lisis por calor con TE + Tritón X-100 y un método comercial. La amplificación de los genes de enterotoxinas de S.aureus (SEA, SEB, SEC, SED y SEE) se realizó utilizando una Multiplex PCR. Para confirmar la identidad de los amplicones obtenidos se realizó una digestión de los mismos con la enzima Rsa I, previo análisis in silico utilizando los servicios on line Blast y NEBCutter. Los fragmentos de ADN resultantes en estas experiencias fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa. Se observó que el proceso de extracción de ADN con agua resultó tan eficaz como el uso de TE + Tritón o de un método comercial, con una disminución en el tiempo total del proceso. Partiendo de ADN obtenido por lisis por calor (en agua), en todas las cepas control utilizadas se pudo identificar el gen de la enterotoxina correspondiente. Además, la digestión con Rsa I generó fragmentos de restricción con los tamaños previstos en el análisis teórico. Esto permitió el uso de una sola reacción de digestión para confirmar la identidad de 5 genes distintos. La metodología de análisis molecular aquí propuesta, nos permitió detectar 5 genes de enterotoxinas de Staphylococcus aureus con una mejora -en términos de economía, practicidad y tiempo de ejecución- en comparación con otros procedimientos previamente reportados. Con esta metodología pudimos detectar genes de SEs, en distintas cepas de S aureus recuperadas en diferentes brotes de intoxicación alimentaria.