Utilidad del papel de filtro para el diagnóstico molecular de la infección por Trypanosoma cruzi

Abstract

La enfermedad de Chagas es causada por el protozoo Trypanosoma cruzi y afecta entre 6 y 7 millones de personas en el mundo, la mayoría de ellas residentes en América Latina. El diagnóstico de certeza implica la demostración de la presencia del parásito durante la fase aguda de la infección y la detección de anticuerpos específicos en la etapa crónica; esto presenta limitaciones, debido a la baja sensibilidad de las técnicas parasitológicas y a la baja especificidad de las inmunológicas. Las técnicas moleculares, que detectan secuencias específicas de ADN del parásito son una alternativa, pero sólo se encuentran disponibles en centros de mediana o alta complejidad. En este contexto, nos propusimos evaluar la posibilidad de utilizar el papel de filtro como soporte de sangre para realizar el diagnóstico molecular de la infección por T. cruzi, ya que es una muestra que se puede derivar con facilidad sin perder calidad y es factible aprovechar la misma tarjeta del Programa Nacional de Pesquisa Neonatal, que es obligatorio en Argentina. Se evaluaron distintas metodologías de extracción del ADN en papel de filtro, siendo la utilización de columnas comerciales previa incubación con buffer de lisis de tejido la opción más conveniente, ya remueve eficientemente los inhibidores del papel de filtro. Se evidenció además el pasaje de ADN entre tarjetas contiguas por lo que las mismas se deben conservar separadas para evitar contaminaciones. El límite de detección en papel de filtro fue 8.98 (CI 95% 6.59 -15.04) y 10.33 (CI 95% 7.649 -17.11) eq.par/ml para k-DNA y sat-DNA respectivamente (PCR convencional) y la sensibilidad analítica fue de 1 eq par/ml para la PCR en tiempo real multiplex dirigida a sat-DNA más un control interno de inhibición, mientras que en sangre directa resultaron una concentración de un orden menor en todos los casos. La sensibilidad clínica de las amplificaciones a partir del papel de filtro (tomando como referencia la sangre directa) en recién nacidos, hijos de madres con serología positiva para Chagas fue 94, 88 y 78.9 % para k-DNA, sat-DNA y PCR en tiempo real, respectivamente y en pacientes inmunocomprometidos con riesgo de reactivación chagásica fue de 80, 80 y 81% para k-DNA, sat-DNA y PCR en tiempo real, respectivamente. En todos los casos, la especificidad fue del 100 %. También se evaluó la sensibilidad y especificidad referidas al diagnóstico definitivo (micrométodo y serología) resultando entre 76.9 y 84.6 % para las muestras en papel de filtro y entre 92.3 y 100 % para las muestras en sangre directa La concordancia entre las 3 metodologías de amplificación dió un índice Kappa generalizado 3 de 0.9617 (“Muy Bueno” según interpretación de Landis y Koch, 1977). Asimismo se pudo confirmar el diagnóstico de Chagas congénito a partir de tarjetas originales de pesquisa neonatal y estimar a carga parasitaria al momento del nacimiento.. Hemos llegado a la conclusión que es posible utilizar el papel de filtro como una alternativa más en el diagnóstico de dicha infección ya que aporta ventajas con respecto a las muestras convencionales, en cuanto a la facilidad de toma de muestra, volumen de sangre requerido, condiciones de conservación y de transporte para su derivación, especialmente dirigido a personas que residen en zonas alejadas de los centros de diagnóstico.